SPE固相萃取技術(shù)以及固相萃取儀器裝置調(diào)試

固相萃取的五個步驟

固相萃取過程要求樣品以溶液形式存在，沒有干擾，而且有足夠的濃度以被檢測。固相萃取的發(fā)展過程分為五步：

*步 選擇萃取管

1.正相柱、反相柱、吸附柱：樣品質(zhì)量不超過填料質(zhì)量的5%。

2.LC-SAX和LC-SCX柱：其吸附劑容量為0.2毫當(dāng)量/克（1毫當(dāng)量=1毫摩爾的[+1]或[-1]帶電荷物質(zhì)）。

3.LC-NH2和LC-WCX柱：離子交換容量由應(yīng)用決定。

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第二步 預(yù)處理萃取管

反相類型硅膠和非極性吸附劑介質(zhì)，通常用水溶性有機溶劑，如甲醇，預(yù)處理。甲醇濕潤吸附劑表面和滲透鍵合烷基相，以允許更有效地潤濕硅膠表面。這些溶劑通常與洗脫劑一樣是用于消除固相萃取管上的雜質(zhì)對分析物的干擾，

正相類型固相萃取硅膠和極性吸附劑介質(zhì)通常用樣品所在的有機溶劑來預(yù)處理。離子交換填料:對于非極性有機溶劑中的樣品，用樣品溶劑來預(yù)處理。對極性溶劑中的樣品，用水溶性有機溶劑來預(yù)處理。為了使固相萃取填料從預(yù)處理到樣品加入時都保持潤濕，允許大約1ml的預(yù)處理溶劑在管過濾片上。

第三步 加入樣品當(dāng)過量體積的水溶液被萃取時，反相硅膠填料漸漸減少預(yù)處理時所獲得的溶劑化層。這就會降低萃取效率和樣品的回收率。如果回收率較低或重現(xiàn)性不好，可能是分析物流失。為使適當(dāng)?shù)幕衔锉Ａ粼谔盍仙希疵摶虺恋聿灰衔铮{(diào)節(jié)pH、鹽的濃度和樣品溶液在有機相中的含量。為了避免堵塞固相萃取管的過濾片，如果可能，在萃取之前預(yù)先過濾或離心樣品。流速會影響某些化臺物的保留。一般來說，對于離子交換固相萃取管，流速小應(yīng)大于2ml／min；對于其它上的固相萃取管，流速不應(yīng)大于5ml／min；如果時間不是一個確定因素的話，滴速*。

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第四步 沖洗填料若分析物被保留在填料上，用一種不能洗脫所要化合物的溶液，去沖洗掉不要的物質(zhì)。沖洗液不超過一個管體積。為消除不要的、可能保留很弱的物質(zhì)，用比樣品基質(zhì)強，但其強度又不至于洗脫分析物的的溶劑去沖洗填料。典型的溶液可含有比zui后洗液少一點的有機或無機鹽，也可以調(diào)節(jié)不同的pH。與zui后洗脫液*不同極性的純?nèi)軇┗蛉軇┗旌衔锟蔀橛杏玫南疵撘?/p>

如果選用分析物不被保留在填料上的方案，則應(yīng)用相當(dāng)于一管體積的樣品溶劑去洗脫管上的分析物。在這種情況下，沖洗是作為洗脫來完成萃取過程。

第五步 洗脫感興趣的化合物用少量能洗脫分析物的溶液去沖洗填料（一般2ml-200 ml，取決于管的大小）用兩次少量液體洗脫分析物比用一次大體積更有效，當(dāng)洗脫液停留在填料上為20秒到1分鐘時，分析物的回收率。這一步滴速是zui有利的。

· 對于反相、正相和離子交換過程，一般五步全都需要進行；

· 對于樣品凈化過程，只需要前三步，并且在第三步，分析物將隨著樣品從管內(nèi)流出而收集，干擾雜質(zhì)保留在吸附劑上。

樣品的前處理

除了保證樣品適當(dāng)?shù)膒H值，您還應(yīng)該考慮其它樣品前處理的需要。以下部份描述了在使用固相萃取裝置之前某些很難的樣品應(yīng)該怎樣進行前處理。

土壤和沉積物:土壤和沉積物一般用中等極性到非極性溶劑通過索氏萃取或超聲波處理萃取。萃取物使用正相萃取除去干擾物，再溶解在另一種溶劑之中。如果所分析化合物的萃取取決于PH，土壤和沉積物樣品在萃取和固相萃取凈化之前，要將其均勻化。

植物組織、水果、蔬菜和谷類:植物組織、水果、蔬菜和農(nóng)產(chǎn)品（如動物的食物及谷類），要用水、極性溶劑（如甲醇，乙氰）或水及這些溶劑的混合物來均勻化，用反相及離子交換使之凈化。通過離心或過濾除去沉淀的蛋白質(zhì)和固體后，樣品的pH可能需要調(diào)節(jié)。樣品也可能用中等極性到非極性溶劑均勻化，以用于正相固相萃取。同樣，在用于固相萃取之前，樣品可能需要離心或過濾。

食用肉類、魚類和動物組織:食用肉類、魚類和其它的動物組織要在水中均勻化，如用于反相和離子交換的樣品，可能需要用酸（一般為鹽酸或三鹵乙酸）水解或降解食用肉類及組織、或者用堿（如*）皂化。樣品接著可離心，取上層溶液用于正相固相萃取。

藥片和其它藥用固體樣品:藥片和其它藥用固體樣品應(yīng)粉碎成細粉狀，然后用水或適當(dāng)?shù)木彌_溶液萃取或均勻化，使用反相或離子交換固相萃取。中等極性到非極性溶劑用于正相凈化過程

清、漿、：清和漿樣品不需要前處理即可用于固相萃取。然而，在很多情況下，分析物（如藥物）可能結(jié)合在蛋白質(zhì)上，它會降低固相萃取的回收率。為了破壞生物體液內(nèi)蛋白質(zhì)的鍵合，在反相或離子交換萃取過程中，可選用以下方法之一：

    · 用0.1Ｍ或更大濃度堿或酸調(diào)節(jié)pH限值（pH<３或pH>９）。用上層溶液做樣品進行固相萃取。

    · 用極性溶劑如乙氰、甲醇或丙酮沉淀蛋自質(zhì)（通常用兩份溶劑/一份生物體液），混合均勻和離心之后，移取上層溶液，用水或緩沖溶液稀釋即可用于固相萃取。

    · 為沉淀蛋白質(zhì)，用酸或無機鹽如甲酸、高鹵酸、三鹵乙酸、硫酸氨、*或硫酸鋅來處理生物體液。在用于固相萃取之前，上層溶液的pＨ可能需要調(diào)節(jié)。

· 生物體液超聲波處理15分鐘，加入水和緩沖溶液，離心，上層溶液用于固相萃取。

尿：對于反相或離了交換固相萃苯取，尿樣品不需要前處理，但樣品加入前，經(jīng)常需用水或有適當(dāng)pH的緩沖溶液稀釋。但某些情況下，酸水解（對堿性化合物）或堿水解（對酸性化合物）用來保證所分析的化合物在尿樣品中自由溶劑化。通常將一個強酸（如濃鹽酸）或堿（如10Ｍ氫氧化鉀）加入尿中。加熱尿樣15-20分鐘，然后冷卻，用緩沖液稀釋，調(diào)至適當(dāng)?shù)膒H 即可用于固相萃取。也可用酶水解來釋放被結(jié)合的化合物或藥物。

細胞培養(yǎng)介質(zhì)：細胞培養(yǎng)介質(zhì)不用處理即刻使用。某些方法可能需要用水或有適當(dāng)pH的緩沖溶液稀釋其介質(zhì)，以保證分析物在樣品中自由溶劑化。如果細胞培養(yǎng)介質(zhì)含有滿載顆粒，是很難通過固相萃取裝置。在用于固相萃取之前，它可能需要搖動和離心。大部分細胞培養(yǎng)介質(zhì)的固相萃取使用反相和離子交換方法。

牛奶：一般牛奶使用反相和離子交換固相萃取條件。樣品可能要用水和水/極性溶劑混合物（如甲醇，大約至50%）稀釋。某些過程需要用酸處理來沉淀蛋白質(zhì)（典型的鹽酸、硫酸、三鹵乙酸）。沉淀以后，樣品要離心，上層溶液即用于固相萃取。

水樣品：飲用水、地下水及污水只要不含大量固體顆粒，可直接用于同相萃取。地下水及污水在使用固相萃取之前可能需要過濾，如果所分析的化合物被結(jié)合在被遺棄的顆粒上，過濾會降低其回收率。如有可能盡量不過濾樣品，讓未過濾樣品直接通過固相萃取裝置，在洗脫過程中，讓溶劑通過在吸附劑之上的顆粒，這將提高回收率。因為用這種方法，被結(jié)合在顆粒上的要分析化合物將得到回收。在很多情況下，水樣品使用反相或離子交換固相萃取。

酒、啤酒、液體飲料:在反相或離了交換條件下，液體和酒*料不用處理就可用于固相萃取。對反相萃取，如酒精含量很高，需要用水或緩沖溶液稀釋到酒精含量小于10%；如果有固體在樣品之中，在用于固相萃取之前，有必要離心或過濾樣品。

水果汁:水果汁一般不用前處理或離心既可用于固相萃取。如果離心，上層溶液用于固相萃取。粘性果汁可能需要用水或有適當(dāng)pH的緩沖溶液來稀釋。

藥用液體樣品:因為液體藥品主要是水溶液，這類樣品使用反相或離子交換固相萃取。如果樣品具有粘性，必須用水或有適當(dāng)?shù)木彌_溶液來稀釋。樣品的有機萃取物可能要用正相固相萃取。

油類:碳氫或脂肪油通常是在正相萃取條件下分析的，因為它們不能用水稀釋。稀釋溶劑常選用中等極性到非極性溶劑，如正己烷和鹵化劑。稀釋的樣品通過正相鍵合硅膠或吸附劑，樣品在通過時被收集。所分析的化合物通過而不被保留，雜質(zhì)則被保留在吸附劑上。如果分析物被保留在填料之上，不斷地用增加溶劑的極性或用極性稀釋混合物沖洗固相萃取填料，直到分析物回收到某*份之中。為收集水樣品中的油，使用反相同相萃取。

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SPE固相萃取裝置安裝調(diào)試

[1]小心地取出固相萃取裝置，輕放于工作臺上。

[2]小心地取出SPE裝置上蓋板(輕拿輕放以免碰壞小管)，將標(biāo)準(zhǔn)試管插入真空倉內(nèi)隔板孔中，然后，將上干蓋板蓋好，并保證蓋板下導(dǎo)流管與試管一一對應(yīng)好，蓋板方形密封圈與真空倉有很好的密封性。如果不易密封，可用橡皮箍箍緊，以增加密封性；

[3]如果選購了獨立調(diào)節(jié)就要先將調(diào)節(jié)閥插入蓋板萃取孔中；

[4]如果一次不需要做12或24個樣品，不用的萃取孔插上針管密閥；

[5]如選購了獨立調(diào)節(jié)閥，將不用的萃取孔的調(diào)節(jié)閥旋鈕旋到水平密封狀態(tài)；

[6]將固相萃取小柱插入到上蓋萃取孔中或閥孔內(nèi)（將調(diào)節(jié)閥旋鈕旋到直立打開狀態(tài)）；用膠管連接萃取裝置和真空泵，擰緊壓力調(diào)節(jié)閥門；

[7]將需要萃取的樣品或試劑分別注入到萃取柱中，啟動真空泵，則萃取柱中的樣品將在負壓力的作用下通過萃取柱流到下面的試管中。此時可通過調(diào)節(jié)減壓閥來調(diào)節(jié)控制液體流速；

[8]待針管內(nèi)液體抽完后關(guān)閉真空泵，將富集柱從裝置上拔下，取下裝置上蓋板，拿出試管倒掉；

[9]如不想用試管接液，可將試管架取出，放入合適大小的容器，*次萃取后取出倒掉；

[10]再將干凈試管放入裝置，蓋好上蓋板，插好SPE小柱，用所需萃取溶劑加入針管，啟動真空泵，至液體抽干后關(guān)掉電源，取出試管備用。萃取制樣完畢；

[11]將試管放入氮氣吹干儀中用氮氣吹掃濃縮，制備完畢；

[12]處理好試管中的溶劑，并將試管沖洗干凈以備再用；

[13]為了節(jié)省SPE柱的使用成本，每次使用后，應(yīng)將SPE柱用淋洗液沖洗干凈，保證其填料的活性。

SPE固相萃取技術(shù)以及固相萃取儀器裝置調(diào)試參考資料：杭州聚同電子有限公司