由于CO2培養箱受使用環境和條件的影響較大，許多廠家在產品設計上仍保留用戶重新校準的部件，一般是在面板上設有校準和調零微調。無論哪種類型的產品，校準工作都應在箱內的溫度和濕度穩定之后進行。
　　1、溫度校準：
　　有的產品在出廠前已完成溫度校準工作，校準部件均安裝在箱內的控制板上，用戶不宜再作調整。對于面板上有校準微調的產品，可在接近培養溫度下(如37℃)，取一根精密溫度計置于箱內，待溫度穩定后觀察溫度計指示值，如與顯示值不跗，調整微調使其相附即可。
　　溫度的校準步驟：
　　①在培養箱內放置一個準確的玻璃管式水銀溫度計，以校準所設定溫度。同時，再放置一個準確的體溫計，以校準極限溫度。
　　②把溫度旋鈕調到所需溫度37℃。
　　③把極限溫度旋鈕調到大。等待24小時，讓機器達到穩定。
　　④如果溫度還沒達到37℃，再調整溫度旋鈕到37℃，然后再等待24小時，讓機器后達到穩定。
　　⑤當培養箱穩定在37℃后，按逆時針方向轉動極限溫度旋鈕，直到該極限溫度旋鈕的指示燈明亮為止。
　　⑥再小心地把極限溫度旋鈕順時針方向轉動，直到指示燈剛好熄滅為止。
　　注意:機器正常運轉期間，其極限溫度指示燈應保持熄滅狀態。當箱內溫度高于極限溫度時，該指示燈點亮報警。如果面板液晶顯示溫度與箱內溫度計讀數不符，可進一步調整校準。首先，調整顯示器點，直到讀數與水銀溫度計的讀數相吻合，然后，等待數小時，讓機器穩定。如果還不相符，可重復上一步驟，直到機器達到終穩定。
　　2、CO2濃度校準：
　　先進行零點校準。在CO2培養箱的氣體條件中，一般是以空氣中的CO2濃度為零點的，故在箱內充滿新鮮空氣時的顯示值應為0。校準時先斷開氣源，打開箱門數分鐘后再關閉，待溫、濕度穩定后兩整調零微調使顯示值為0。
　　CO2濃度校準一般采用氣體分析法和標準氣體法兩種方法。前者是通過面板上的氣體采樣孔采取箱內氣體樣品，經分析獲得CO2實際濃度，再校正顯示值;后者是將已知CO2濃度的標準氣體充人箱內，再校正顯示值。
　　對比之下，氣體分析法成本較低，但需具備氣體分析條件或進有關部門檢驗;標準氣體法較為方便，但購買標準氣價格較貴。校準時應注意，零點校準與濃度枝準相互有一定影響，所以這兩項校準應反復進行至少三次。